Kompleksowa analiza porównawcza mykobiomu jelitowego pacjentów pediatrycznych z chorobą Leśniowskiego-Crohna, z zastosowaniem sekwencjonowania nowej generacji (NGS)
Agnieszka Krawczyk1*, Dominika Salamon1, Agnieszka Sroka-Oleksiak1, Barbara Zapała2, Tomasz Gosiewski1
1 Zakład Molekularnej Mikrobiologii Medycznej, Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum, Polska
2 Katedra Biochemii Klinicznej, Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum, Polska
*E-mail: agnieszka.krawczyk@doctoral.uj.edu.pl
WPROWADZENIE: Choroba Leśniowskiego-Crohna (chL-C) to przewlekła choroba zapalna przewodu pokarmowego przebiegająca z okresami zaostrzeń, w których obserwuje się nasilenie objawów chorobowych, przeplatanych epizodami remisji, w których następuje łagodzenie bądź całkowite ustąpienie dolegliwości. Patogeneza choroby pozostaje nieznana, jednak coraz więcej danych wskazuje, że obok czynników genetycznych i immunologicznych, mikrobiom jelitowy odgrywa kluczową rolę w rozwoju stanu zapalnego w przebiegu chL-C. Dotychczasowe badania koncentrowały się przede wszystkim na roli bakterii w etiologii choroby, natomiast rzadko uwzględniano udział grzybów, które również wchodzą w skład mikrobioty jelitowej człowieka.
CEL: Celem badania była kompleksowa analiza składu mykobiomu z zastosowaniem sekwencjonowania nowej generacji (NGS), wśród pacjentów pediatrycznych z chL-C w porównaniu do osób zdrowych oraz korelacja uzyskanych wyników z parametrami biochemicznymi i klinicznymi pacjentów.
MATERIAŁ I METODY: Materiał poddany badaniom stanowiły próbki kału pobrane od dzieci:
I) z chL-C w okresie zaostrzenia choroby (n=66)
II) z chL-C w fazie remisji (n=39)
III) zdrowych, stanowiących grupę kontrolną (n=40)
Z próbek kału wyizolowano grzybicze DNA, stosując lizę enzymatyczną i mechaniczną w celu zwiększenia efektywności procesu izolacji. Następnie, każdą z próbek amplifikowano podczas reakcji PCR, ze starterami ukierunkowanymi na region ITS-1 w celu stworzenia bibliotek genomowych. Sekwencjonowanie NGS wykonano w oparciu o protokół i platformę do sekwencjonowania MiSeq (Illumina).
WYNIKI: Zastosowanie sekwencjonowania NGS pozwoliło uzyskać pełny obraz składu mykobioty jelitowej od poziomu phylum (L2) do species (L7). Zaobserwowano różnice w profilach mykobioty pomiędzy grupą pacjentów z chL-C a zdrową populacją.
WNIOSKI: Niezbędne są dalsze badania, mające na celu wyjaśnienie, czy obserwowane zmiany mogą odgrywać rolę w indukcji choroby u osób predysponowanych genetycznie do chL-C, czy są one jedynie efektem wtórnym choroby.