Jakościowa i semi-ilościowa analiza składu mikrobioty górnych dróg oddechowych pacjentów z COVID-19 w zależności od intensywności replikacji wirusa SARS-CoV-2
Katarzyna Talaga-Ćwiertnia1*, Agnieszka Sroka-Oleksiak1, Dominika Salamon1, Agnieszka Krawczyk1,
Barbara Zapała2, Monika Brzychczy-Włoch1, Tomasz Gosiewski1
1 Zakład Molekularnej Mikrobiologii Medycznej, Katedra Mikrobiologii, Wydział Lekarski Uniwersytet
Jagielloński Collegium Medicum, Polska
2 Zakład Diagnostyki, Katedra Biochemii Klinicznej, Wydział Lekarski Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum, Polska
* E-mail: katarzyna.talaga@uj.edu.pl
Skład i rola mikrobiomu układu oddechowego w przebiegu zakażeń wirusowych jest nadal słabo poznana. Celem badania była ocena zmian mikrobioty górnych dróg oddechowych w zależności od intensywności replikacji wirusa SARS-CoV-2, wyrażonej poprzez parametr Cq w ilościowym PCR (qPCR). Grupę badaną stanowiło 60 pacjentów Szpitala Uniwersyteckiego w Krakowie z COVID-19.
Analizowanym materiałem były wymazy z nosogardzieli pobrane bezpośrednio po przyjęciu pacjentów do szpitala, przed zastosowaniem antybiotykoterapii. Z próbek klinicznych równolegle przeprowadzono izolację wirusowego RNA i bakteryjnego DNA. W pierwszym etapie izolaty RNA poddano amplifikacji metodą qPCR w celu potwierdzenia obecności wirusa SARS-CoV-2 i określenia wartości progowej cyklu (Cq).
W zależności od uzyskanej wartości Cq badane próbki zostały przyporządkowane do jednej z trzech grup: I– Cq ≤31.0 (n=20; wysoki poziom replikacji), II – Cq > 31.0 (n=20; niski poziom replikacji), III- Cq = 0 (n=20; brak RNA wirusa). W drugim etapie izolaty zawierające bakteryjne DNA poddano amplifikacji metodą PCR (amplifikowano region V3-V4 podjednostki 16S RNA). Uzyskane amplikony posłużyły do przygotowania biblioteki genomowej do sekwencjonowania NGS w sekwenatorze MiSeq (Illumina).
Zaobserwowano, że różnorodność α (wyrażona indeksem Shannon) oraz β (wyrażona indeksami BrayCurtis oraz Jansen-Shannon) istotnie różniły się pomiędzy badanymi grupami (odpowiednio p dla α <0.044 i β <0.021 oraz <0.013). Na poziomie gatunku przy użyciu liniowej analizy dyskryminacyjnej (LDA score) wytypowano unikatowe dla danych grup bakterie: Bacteroides uniformis (III), Prevotella maculosa, Corynebacterium pilbarense (II). Z kolei w grupie I były to m.in. Pseudomonas beteli, Faecalibacterium prausnitzii, Bacteroides dorei, Akkermansia muciniphila, Enterococcus faecium oraz Bacteroides vulgatus. W przebiegu zakażenia w I grupie pacjentów charakterystyczna była obecność znacznego odsetka bakterii patogennych, wśród których na szczególną uwagę zasługują Bacteroides vulgatus i Akkermansia muciniphila. Bakterie te odpowiadają za degradację mucyny i mogą przyczynić się do zniszczenia śluzówki górnych dróg oddechowych, a w konsekwencji inicjować przejściową kolonizację przez inne bakterie o potencjale patogennym, towarzyszące zakażeniu SARS-CoV-2.
Źródło finansowania: Środki NCBiR w ramach projektu SZPITALE-JEDNOIMIENNE/18/2020 realizowany przez konsorcjum Szpitala Uniwersyteckiego w Krakowie oraz CM UJ Opis projektu